【中药炮制】河南中医药大学：基于化学模式识别筛选清炒香附的差异标志物

  香附最早记载于《名医别录》 [1] ，为莎草科植物莎草 Cyperus rotundus L. 的干燥根茎。《本草纲目》 [2] 记载：“生则上行胸膈，外达皮肤，熟则下走肝肾，外彻腰足。炒黑则止血， …… 青盐炒则补肾气，酒浸炒则行经络，醋浸炒则消积聚，姜汁炒则化痰饮”，表明清炒香附具有与辅料炮制香附不同的主治功效。中药炒制方法多样，包括清炒、麸炒、土炒等，香附清炒法最早见于《银海精微》，记载香附清炒法的本草古籍达 61 部 [3] 。香附虽为“女科要药”，但其味辛而行气力强，久用易耗伤根本之气血，因此《妙一斋医学正印种子编》中岳甫嘉多为炒用 [4] 。关于炒制程度，历代古籍中多有提及“微炒”“炒焦”“炒黑”，用来医治不同病症 [3] ，明代《医学入门》 [5] 记载：“气病略炒”，清代《药品化义》 [6] 记载：“炒黑治淋漓及崩漏”，即不同清炒程度的香附确有不同主治功效。目前多为化学成分 [7] 、药理 [8-11] 、辅料炮制、药用部位以及产地等内容的研究 [12-17] ，未见涉及清炒。

  基于以上内容，为排除产地等方面的影响，选择河南产地香附做多元化的分析研究，采用高效液相色谱法（ HPLC ），结合化学模式识别，筛选出差异标志物，对香附饮片、清炒香附、香附炭的 HPLC 指纹图谱、指标成分等进行探讨，以期为清炒香附药效物质基础研究提供实验依据，为加强完善香附品质衡量准则提供参考。

  Agilent 1200 型高效液相色谱仪，美国 Agilent 公司； ME204E 型万分之一分析天平、 AB135-S 型十万分之一分析天平，上海梅特勒 - 托利多仪器有限公司； HH-S6 型电子恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司； KQ-700DB 型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司； FW-100 型高速万能粉碎机，北京科伟永兴仪器有限公司； 101-3AB 型点热恒温鼓风干燥箱，北京中兴伟业仪器有限公司。

  对照品 α- 香附酮（批号 MUST-22041007 ）、香附烯酮（批号 MUST-22011201 ）、阿魏酸（批号 MUST-19032928 ），质量分数均≥ 98.0% ，成都曼斯特生物科技有限公司；对照品木犀草素，批号 DST191020-032 ，质量分数≥ 98.0% ，上海源叶生物科技有限公司；对照品对香豆酸（批号 AF20041951 ）、 5- 羟基甲基糠醛（ 5-HMF ，批号 AF21030751 ），质量分数均≥ 98.0% ，成都埃法生物科技有限公司；甲醇，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；磷酸，天津市利密欧化学试剂有限公司；娃哈哈纯净水。

  7 批香附药材于 2021 年采集于河南省新郑市大关村，经河南中医药大学陈随清教授鉴定为莎草科莎草属植物莎草 C. rotundus L. 的干燥根茎，燎后直接晒干，切成厚片，备用。 7 批净香附饮片分别编号 S1 ～ S7 。

  2.1.1清炒香附 净香附饮片（ S1 ～ S7 ）文火加热，炒至内部焦黄，取出，放凉，即得清炒香附（ S8 ～ S14 ）。

  2.1.2香附炭 净香附饮片（ S1 ～ S7 ）中火加热，炒至表面焦黑色，内部焦褐色，喷淋清水少许，灭尽火星，取出，放凉，即得香附炭（ S15 ～ S21 ）。

  2.2.2 供试品溶液的制备 样品粉碎，精密称取样品粉末适量，置具塞锥形瓶中，精密加入 25 mL 75% 甲醇，称定质量，超声处理（ 250 W 、 40 kHz ） 45 min ，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，经 0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

  2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取 5-HMF 、对香豆酸、阿魏酸、木犀草素、 α- 香附酮和香附烯酮对照品适量，置于 5 mL 量瓶中，加入甲醇溶解，定容，分别得到质量浓度为 549.3 、 370.7 、 326.7 、 119.3 、 220.0 、 193.3 μg/mL 的对照品溶液；分别量取 6 种对照品溶液适量，配制成一定质量浓度的混合对照品溶液。

  2.2.4 精密度试验 精密称取香附炭样品（ S15 ），按“ 2.2.2 ”项下方法制备供试品溶液，再按“ 2.2.1 ”项下色谱条件进样测定 6 次，以 α- 香附酮为参照峰（ S ，较于其他成分峰面积大，峰形较好，故作为参照峰），计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间的 RSD 分别为 0.49% 、 0.16% ，表明仪器精密度良好。

  2.2.5 重复性试验 精密称取香附炭样品（ S15 ），按“ 2.2.2 ”项下方法平行制备 6 份供试品溶液，再按“ 2.2.1 ”项下色谱条件进样测定，以 α- 香附酮为参照峰，计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间的 RSD 分别为 0.48% 、 0.37% ，表明该方法重复性良好。

  2.2.6 稳定性试验 精密称取香附炭样品（ S15 ），按“ 2.2.2 ”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置 0 、 2 、 4 、 6 、 12 、 24 h ，按“ 2.2.1 ”项下色谱条件进样测定，以 α- 香附酮为参照峰，计算共有峰的相对峰面积和相对保留时间的 RSD 分别为 0.49% 、 0.37% ，表明供试品溶液在室温下放置 24 h 内稳定

  2.2.8 HCA 将 23 个共有峰峰面积做处理，导入 SPSS.19.0 软件，采用组间连接法，以欧氏距离为分类依据，对样品进行系统聚类分析，结果见图 3 。可知，当组间距离为 2 时， 21 批样品可聚为 3 类： S1 ～ S7 聚为一类， S8 ～ S14 聚为一类；当组间距离为 10 时，可聚为 2 类。

  2.2.10 OPLS-DA 为进一步寻找影响不同样品间差异的成分，以 23 个共有峰峰面积为变量，采用 SIMCA 14.1 软件进行 OPLS-DA 。结果显示， R 2 X ＝ 0.911 、 R 2 Y ＝ 0.988 、 Q 2 ＝ 0.982 均大于 0.5 ，表明模型拟合度较好，具有较高的稳定性与预测能力，结果见图 5 。可知， 21 批样品可分为 3 类，与 HCA 结果、 PCA 结果一致；为避免建立的 OPLS-DA 模型 出现过度拟合而影响分析结果的准确性，利用 200 次置换试验分别进行置换检验，结果见图 6 ，显示置换后的 R 2 ＝ −0.028 8 ＜ 0.3 、 Q 2 ＝ −0.438 ＜ 0.05 ，表明所建模型可靠，未出现过度拟合现象，可用于标志物的筛选。

  将 23 个共有峰峰面积导入 SIMCA 14.1 软件，对各共有峰的变量重要性投影（ variable importance in projection ， VIP ）值做多元化的分析，并以 VIP ＞ 1 为标准筛选贡献较大的差异性成分 [20] ，结果见图 7 。可知， VIP ＞ 1 的共有峰依次为 2 、 23 （ α- 香附酮）、 17 （木犀草素）、 10 （对香豆酸）、 11 （阿魏酸），提示为导致样品间差异的主要标志色谱峰。

  2.3.1 系统适用性试验 取“ 2.2.3 ”项下混合对照品溶液及“ 2.2.2 ”项下供试品溶液 S10 、空白溶剂（ 75% 甲醇），按“ 2.2.1 ”项下色谱条件进样测定，记录 HPLC 指纹图谱，结果见图 8 。可知，供试品溶液、混合对照品溶液中各色谱峰的分离度良好，空白溶剂对测定无干扰。

  2.3.4 稳定性试验 取“ 2.2.2 ”项下香附炭供试品溶液（ S15 ），分别于室温下放置 0 、 2 、 4 、 6 、 12 、 24 h 时按“ 2.2.1 ”项下色谱条件进样测定，记录 5-HMF 、对香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、 α- 香附酮的峰面积，得 5-HMF 、对香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、 α- 香附酮峰面积的 RSD 分别为 1.54% 、 0.97% 、 0.67% 、 0.16% 、 0.49% 、 0.28% ，表明供试品溶液于室温下放置 24 h 内稳定性良好。

  2.3.5 重复性试验 取香附炭样品（ S15 ），共 6 份，按“ 2.2.2 ”项下方法制备供试品溶液，再按“ 2.2.1 ”项下色谱条件进样测定，记录 5-HMF 、对香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、 α- 香附酮的峰面积，并计算含量，得 5-HMF 、对香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、 α- 香附酮质量分数的 RSD 分别为 2.19% 、 1.64% 、 0.79% 、 0.26% 、 0.37% 、 0.94% ，表明该方法重复性良好。

  2.3.6 加样回收率试验 分别精密称取已知含量的香附炭样品（ S15 ） 9 份，分为 3 组，分别按样品中成分含量的 50% 、 100% 和 150% 加入对应成分的单一对照品，按“ 2.2.2 ”项下方法制备供试品溶液，再按“ 2.2.1 ”项下色谱条件进样测定，记录 5-HMF 、对香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、 α- 香附酮的峰面积并计算加样回收率与 RSD 。计算得 5-HMF 、对香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、 α- 香附酮的平均加样回收率分别为 98.17% 、 98.64% 、 97.68% 、 98.12% 、 98.69% 、 98.57% ， RSD 分别为 1.69% 、 1.89% 、 1.34% 、 1.56% 、 1.49% 、 1.83% ，表明方法准确度良好。

  2.3.7 样品测定 分别精密称取 21 批香附样品，按“ 2.2.2 ”项下方法制备供试品溶液，再按“ 2.2.1 ”项下色谱条件进样，记录峰面积，并计算样品中各指标成分含量，对香附饮片与清炒香附、香附炭中各成分含量的平均值作比较，结果见表 1 、 2 。由表 5 可知， 5-HMF 含量在香附饮片、清炒香附、香附炭中逐渐增加，炒炭后 5-HMF 显著增加；对香豆酸、阿魏酸含量在香附饮片、清炒香附、香附炭中逐渐增加；清炒香附中木犀草素含量最高；香附烯酮含量在香附饮片、清炒香附、香附炭中呈下降趋势； α- 香附酮在香附炭中含量最低，香附饮片经炒后 α- 香附酮含量略有增加。

  HPLC 指纹图谱研究结果为， 21 批样品的相似度均不小于 0.934 ，共标定 23 个共有峰，指认出 3 号峰为 5-HMF ， 10 号峰为对香豆酸， 11 号峰为阿魏酸， 17 号峰为木犀草素， 21 号峰为香附烯酮， 23 号峰为 α- 香附酮； PCA 结果、 OPLS-DA 结果与 HCA 结果一致，均可分为 3 类，即香附饮片、清炒香附、香附炭存在一定差别，其规律符合中药炮制基础原理 [21] ；通过 VIP 法筛选出对样品影响较大的成分，筛选出未知成分 2 号峰和已知成分 α- 香附酮、木犀草素、对香豆酸、阿魏酸为差异标志物。

  含量测定结果为， 5-HMF 、对香豆酸、阿魏酸、木犀草素、香附烯酮、 α- 香附酮的质量分数分别为 3.7 ～ 518.0 、 10.2 ～ 24.6 、 56.4 ～ 147.5 、 40.8 ～ 67.7 、 121.9 ～ 134.4 、 149.1 ～ 160.2 μg/g ； 5-HMF 在香附炭中含量最高，推测与炮制程度有关 [22-25] ；对香豆酸、阿魏酸在香附饮片中含量最少，香附炭中含量最高，研究报道含有阿魏酸的药材在体外干燥过程中会与阿魏酸松柏酯相互转化 [26] ，推测与其有关；木犀草素在清炒香附中含量最高； α- 香附酮含量经炒后略有增加，有研究报道在炮制过程中，香附烯酮转化为 α- 香附酮，致使其含量增加 [27] ，推测与其有关；香附烯酮含量在香附饮片、清炒香附、香附炭中含量慢慢地减少，推测与炮制过程中挥发性成分损失有关 [28] ，提示在炮制的过程中应控制时间与温度。

  综上所述，本研究筛选出未知成分 2 号峰与已知成分 α- 香附酮、木犀草素、对香豆酸、阿魏酸为差异标志物；所建立的 HPLC 指纹图谱与含量测定方法简单易操作、准确，能够为清炒香附药效物质基础研究提供实验依据，可为加强完善香附品质衡量准则提供参考。

  来 源：杨颜溶，田瀚举，李莹莹，贾 豪，雷敬卫，龚海燕，谢彩侠． 基于化学模式识别筛选清炒香附的差异标志物 [J]. 中草药, 2023, 54(5):1411-1418.

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